Три фракции днк эукариот, их локализация в хромосомах и функции. Три фракции днк эукариот, их локализация в хромосомах и функции Структурные и функциональные компоненты хроматина

Хроматин представляет собой массу генетического вещества, состоящего из ДНК и белков, которые конденсируются с образованием хромосом во время деления эукариотических . Хроматин содержится в наших клеток.

Основная функция хроматина состоит в том, чтобы сжать ДНК в компактную единицу, которая будет менее объемной и сможет войти в ядро. Хроматин состоит из комплексов небольших белков, известных как гистоны и ДНК.

Гистоны помогают организовать ДНК в структуры, называемые нуклеосомами, обеспечивая фундамент для обертывания ДНК. Нуклеосома состоит из последовательности нитей ДНК, которые обертываются вокруг набора из восьми гистонов, называемых октомерами. Нуклеосома дополнительно складывается с получением хроматинового волокна. Хроматиновые волокна свертываются и конденсируются с образованием хромосом. Хроматин позволяет осуществить ряд клеточных процессов, включая репликацию ДНК, транскрипцию, восстановление ДНК, генетическую рекомбинацию и деление клеток.

Эухроматин и гетерохроматин

Хроматин внутри клетки может быть уплотнен в различной степени в зависимости от стадии клетки в . Хроматин в ядре содержится в виде эухроматина или гетерохроматина. Во время интерфазы, клетка не делится, а подвергается периоду роста. Большая часть хроматина находится в менее компактной форме, известной как эухроматин.

ДНК подвергается воздействию эухроматина, что позволяет проводить репликацию и транскрипцию ДНК. Во время транскрипции двойная спираль ДНК разматывается и открывается, чтобы можно было скопировать , кодирующие белки. Репликация и транскрипция ДНК необходимы для того, чтобы клетка синтезировала ДНК, белки и при подготовке к делению клеток ( или ).

Небольшой процент хроматина существует как гетерохроматин во время интерфазы. Этот хроматин плотно упакован, что не позволяет проводить транскрипцию гена. Гетерохроматин окрашивается красителями в более темный цвет, чем эухроматин.

Хроматин в митозе:

Профаза

Во время профазы митоза волокна хроматина превращаются в хромосомы. Каждая реплицированная хромосома состоит из двух хроматид, соединенных в .

Метафаза

Во время метафазы хроматин становится чрезвычайно сжатым. Хромосомы выровнены на метафазной пластинке.

Анафаза

Во время анафазы парные хромосомы () отделяются и вытягиваются микротрубочками веретена деления на противоположные полюса клетки.

Телофаза

В телофазе каждая новая перемещается в свое собственное ядро. Хроматиновые волокна разматываются и становятся менее уплотненными. После цитокинеза образуются две генетически идентичные . Каждая клетка имеет одинаковое количество хромосом. Хромосомы продолжают разматывать и удлинять образующий хроматин.

Хроматин, хромосома и хроматида

У людей часто возникают проблемы с различием терминов: хроматин, хромосома и хроматида. Хотя все три структуры состоят из ДНК и находятся внутри ядра, каждый из них определяется отдельно.

Хроматин состоит из ДНК и гистонов, которые упакованы в тонкие волокна. Эти волокна хроматина не конденсируются, но могут существовать либо в компактной форме (гетерохроматин), либо менее компактной форме (эухроматин). Процессы, включая репликацию ДНК, транскрипцию и рекомбинацию, встречаются в эухроматине. При делении клеток хроматин конденсируется с образованием хромосом.

Представляют собой одноцепочечные структуры конденсированного хроматина. Во время процессов деления клеток через митоз и мейоз, хромосомы реплицируются, чтобы гарантировать, что каждая новая дочерняя клетка получает правильное количество хромосом. Дублицированная хромосома является двухцепочечной и имеет привычную форму X. Две нити идентичны и связаны в центральной области, называемой центромером.

Является одна из двух нитей реплицированных хромосом. Хроматиды, соединенные центромером, называются сестринскими хроматидами. В конце клеточного деления сестринские хроматиды отделяются от дочерних хромосом в новообразованных дочерних клетках.

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу. ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9*106. Такую сравнительно малую массу ДНК из препаратов можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют различные организмы, как лен, морской еж, окунь (1, 4-1, 9 пг) или рыба голец и бык (6, 4 и 7 пг).

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека, в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, эти участки играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК.

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями (гены для белков хроматина - гистонов).

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов:

Часто повторяющиеся последовательности (>106 раз), входящие во фракцию сателитной ДНК и не транскрибирующиеся;

Фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному;

Фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

ДНК прокариотического организма представляет собой одну гигантскую циклическую молекулу. ДНК эукариотических хромосом представляет собой линейные молекулы, состоящие из тандемно (друг за другом) расположенных репликонов разного размера. Средний размер репликона около 30 мкм. Тем самым в составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются как независимые единицы. Эти репликоны имеют начальную и терминальную точки синтеза ДНК.

Представим себе, что у эукариотических клеток каждая из хромосомных ДНК, как и у бактерий, является одним репликоном. В этом случае при скорости синтеза 0, 5 мкм в минуту (для человека) редупликация первой хромосомы с длиной ДНК около 7 см должна занять 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом же деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает 7-12 ч.

Удаление гистона H1 из транскрипционно активного хроматина 1*2* . В ранних опытах Дж. Боннера (США) было показано, что ДНК в составе хроматина является гораздо худшей матрицей, чем свободная ДНК. На основании этих наблюдений было высказано предположение, что гистоны являются репрессорами транскрипции.

Л. Н. Ананьева и Ю. В. Козлов в нашей лаборатории поставили задачей выяснить, обладают ли ингибирующим действием все гистоны или только некоторые из них. Для этого из хроматина клеток асцитного рака Эрлиха мышей удаляли гистоны экстракцией растворами NaCl с постепенно повышающейся концентрацией. Полученные препараты служили матрицей для синтеза РНК. Транскрипцию вели в присутствии РНК-полимеразы из кишечной палочки, E. coli, которую брали в избытке, и смеси нуклеозидтрифосфатов. В интервале 0,4-0,6 М NaCl происходила резкая деконденсация материала, выражающаяся в набухании ядерного геля и даже растворении ДНП (если далее вести механическую обработку). При этом, как было показано, избирательно удалялся гистон HI. Одновременно с деконденсацией хроматина происходило резкое усиление его матричной активности (рис. 26). Дальнейшее увеличение концентрации солей в экстрагирующем растворе вело к удалению других гистонов и некоторому, но не слишком выраженному дополнительному увеличению матричной активности.

0 t. Тем самым гибридизуемость выявляет процентное содержание в синтезированной РНК повторяющихся последовательностей (по результатам, полученным Л. Н. Ананьевой, Ю. В. Козловым и автором); б - основные параметры синтеза РНК на разных матрицах: свободной ДНК, исходном хроматине (ДНП 0) и хроматине, из которого удален гистон H1 экстракцией 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели с помощью РНК-полимеразы кишечной палочки в присутствии меченых нуклеозидтрифосфатов: [ 14 C]-ATP и либо [γ- 32 P]-ATP, либо [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалась во всю РНК, a [γ- 32 P] - только в начало цепи (pp x A- или pp x G). Иными словами, включение [ 32 Р] давало информацию об инициации синтеза, а [ 14 С] - о самом синтезе РНК. В части опытов через 3-4 мин после начала инкубации в среду добавляли рифампицин-антибиотик, препятствующий инициации новых цепей РНК, но не влияющий на уже начатый синтез, т. е. на элонгацию. 1 - включение [ 14 С] - UMP, 2 - то же после добавления рифампицина; 3 - включение [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - то же после добавления рифампицина. На основании этих кривых включения можно рассчитать основные параметры РНК-полимеразной реакции (по результатам, полученным Ю. В. Козловым и автором)">
Рис. 26. Влияние гистона H1 на матричную активность ДНК в составе хроматина. а - влияние удаления белков из хроматина (1) на матричную активность (2) последнего в присутствии экзогенной РНК-полимеразы кишечной палочки, а также на гибридизуемость синтезирующейся РНК (3). Гистоны и негистоновые белки экстрагировали растворами NaCl повышающейся концентрации. В интервале 0,4 М NaCl - 0,6 М NaCl избирательно удалялся гистон H1. Синтезированную РНК гибридизовали с избытком ДНК при промежуточных величинах С 0 t. Тем самым гибридизуемость выявляет процентное содержание в синтезированной РНК повторяющихся последовательностей (по результатам, полученным Л. Н. Ананьевой, Ю. В. Козловым и автором); б - основные параметры синтеза РНК на разных матрицах: свободной ДНК, исходном хроматине (ДНП 0) и хроматине, из которого удален гистон H1 экстракцией 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели с помощью РНК-полимеразы кишечной палочки в присутствии меченых нуклеозидтрифосфатов: [ 14 C]-UTP и либо [γ- 32 P]-ATP, либо [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалась во всю РНК, a [γ- 32 P] - только в начало цепи (pp x A- или pp x G). Иными словами, включение [ 32 Р] давало информацию об инициации синтеза, а [ 14 С] - о самом синтезе РНК. В части опытов через 3-4 мин после начала инкубации в среду добавляли рифампицин-антибиотик, препятствующий инициации новых цепей РНК, но не влияющий на уже начатый синтез, т. е. на элонгацию. 1 - включение [ 14 С] - UMP, 2 - то же после добавления рифампицина; 3 - включение [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - то же после добавления рифампицина. На основании этих кривых включения можно рассчитать основные параметры РНК-полимеразной реакции (по результатам, полученным Ю. В. Козловым и автором)

Исследовались также и свойства синтезированной in vitro РНК с помощью гибридизации с тотальной ДНК мышей. При этом выявлялась фракция РНК, синтезированная на повторяющихся последовательностях ДНК. Оказалось, что в хроматине транскрипция повторяющихся последовательностей ДНК ограничена. Однако уже после экстракции хроматина 0,6 М NaCl, когда удалялся гистон H1, гибридизационные свойства РНК, синтезированной на матрице такого хроматина и на матрице свободной ДНК, становились неразличимыми. Мы предположили, что гистоны H2a, H2b, H3 и H4 (тогда их называли иначе - умеренно богатые лизином и богатые аргинином гистоны) не участвуют в подавлении транскрипции, а играют чисто структурную роль в организации хроматина, тогда как гистон H1 (в старой терминологии гистон, богатый лизином) является ингибитором синтеза РНК. Одновременно он же является фактором, обусловливающим конденсацию хроматина (см. выше).

Позднее Ю. В. Козлов изучил механизм ингибирования транскрипции гистоном H1, опять-таки на бесклеточной системе с РНК-полимеразой, выделенной из Е, coli. Было изучено влияние гистона H1 на процессы инициации и элонгации (см. рис. 26, табл. 4). Оказалось, что он в несколько раз снижает число цепей РНК, инициируемых на матрице нативного хроматина. Особенно резко ингибируется элонгация: РНК-полимераза прочитывает не более 100-150 п. н. ДНК, после чего останавливается. Между тем на хроматине, из которого гистон H1 удален, РНК-полимераза прочитывает по несколько тысяч пар нуклеотидов, причем длина цепей не отличается от длины цепей, синтезируемых на матрице свободной ДНК. Правда, на свободной ДНК по сравнению с хроматином, из которого удален гистон H1, более эффективно идут процессы инициации синтеза РНК. Был сделан вывод, что гистон H1, конденсируя хроматин, создает препятствия на пути РНК-полимеразы и останавливает тем самым синтез РНК.

* (ДНПМ - ДНП, изолированный с помощью обработки мочевиной, который полностью солюбилизирован, но при этом сохраняет гистон H1. )

В свете современных данных о соленоидном строении 300 А-ДНП фибриллы, которое зависит от присутствия гистона H1, этот результат легко объясним. Действительно, в соленоиде РНК-полимераза, очевидно, не может прочитать более 100 п. н. из-за чисто топологических запретов.

Согласно нашей гипотезе, при активации гена должно было происходить удаление гистона H1. Однако проверить ее в то время не удалось. Лишь сравнительно недавно появились данные об утрате гистона H1 из хроматина при активации генов. Так, при выделении активно транскрибируемых областей хроматина, например мини-ядрышек из ряда организмов, в них не был обнаружен гистон H1. Нет его и у дрожжей, где все гены потенциально активны.

Убедительные результаты были получены в лаборатории А. Д. Мирзабекова В. Л. Карповым и О. В. Преображенской . Они разработали метод "гибридизации с тенями гистонов". Для этого ДНК сшивали с гистонами с помощью диметилсульфата в условиях, когда пришивается в среднем одна молекула гистона на отрезок ДНК длиной около 200-300 п. н. Затем ДНК фрагментировали и проводили двумерный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После прогона в первом направлении разрушали пришитые к ДНК гистоны протеиназой и вели разгонку во втором направлении уже свободной ДНК. Так как при первом раунде электрофореза разные гистоны по-разному замедляли движение фрагментов ДНК, то после второго прогона выявлялось несколько диагоналей (рис. 27). Обычно хорошо видны три: одна, соответствующая исходно свободной ДНК, другая - исходным комплексам ДНК с сердцевинными гистонами и третья (нижняя) - исходному комплексу ДНК с гистоном H1. Полученные ДНК переносятся на фильтр и гибридизуются с той или иной пробой. Если для гибридизации брали неактивный участок генома, например спейсер рибосомного гена дрозофилы, то метка связывалась со всеми диагоналями. Если, однако, как пробу использовали ген теплового шока, который транскрибировался в клетках, из которых выделяли хроматин, то гибридизация с диагональю, соответствующей комплексам ДНК с гистоном H1, была резко ослаблена или вообще отсутствовала. Иными словами, в ядрах перед пришивкой ДНК транскрибируемого гена не имела контактов с гистоном H1.

Рис. 27. Утрата гистона H1 и сердцевинных гистонов при активации транскрипции. Опыты велись на клетках культуры D. melanogaster (а, б) в условиях культивирования при 25° (а) и теплового шока (б). В случае а экспрессия генов теплового шока отсутствует, в случае б - идет весьма активно. Кроме того, опыты велись на дехорионизованных эмбрионах (в), где экспрессия генов теплового шока находится на среднем уровне. После образования ДНК-белковых комплексов, выделения фрагментов ДНК, их двумерного разделения (в вертикальном направлении после удаления белка) и переноса на фильтр вели гибридизацию одних и тех же фильтров с разными пробами: с регуляторной областью гена р70 теплового шока (ТШ-5"); с кодирующей областью того же гена (ТШ-код); с пробой транскрипционно неактивной инсерции в ген рДНК (неакт.). В неактивном гене видны три диагонали; 1 - свободная ДНК, 2 - комплексы ДНК с гистонами октамера; 3 - комплексы ДНК С гистоном H1. Видно ослабление или исчезновение ДНК-гистоновых комплексов при активации хроматина (по результатам, полученным А. Д. Мирзабековым и соавт.)

Хотя все имеющиеся сейчас данные, взятые по отдельности позволяют и другие интерпретации, в совокупности они служат серьезным свидетельством в пользу удаления гистона H1 из активного хроматина. Однако механизм этого процесса пока совершенно неясен.

Судьба нуклеосом при активации хроматина 2* [ 154-157]. Менее однозначным является вопрос о судьбе гистонов H2a, H2b, H3 и H4, формирующих сердцевину нуклеосомы. В вышеупомянутых опытах Ю. В. Козлова их присутствие практически не влияло на транскрипцию ДНК РНК-полимеразой из E. coli. При изучении продуктов гидролиза хроматина эукариот многие авторы нашли, что нуклеосомы содержат ДНК активных генов, т. е. последние тоже организованы в нуклеосомы. Полученные на большом экспериментальном материале данные А. Д. Мирзабекова и сотр. показывают, что нуклеосомы, содержащие активно транскрибируемую ДНК, принципиально устроены так же, как и нуклеосомы, содержащие неактивную ДНК, хотя некоторые ДНК-гистоновые контакты в них изменяются.

Были также проведены опыты по гибридизации с тенями гистонов, о которых шла речь в предыдущем разделе (см. рис. 27). Препараты с диагоналями готовили из клеток дрозофилы, в которых гены теплового шока либо вообще не работали, т. е. были выключены, либо они работали на низком уровне, или, наконец, они были стимулированы тепловым шоком к активной транскрипции. Во всех случаях контрольной пробой служила ДНК спейсера рибосомного гена, которая гибридизовалась во всеми тремя диагоналями, в том числе с диагональю, произошедшей из комплексов ДНК с сердцевинными гистонами.

Ген теплового шока тоже нормально гибридизовался с этой диагональю из клеток, где он не транскрибировался. Однако с материалом, полученным из клеток с умеренной транскрипцией гена теплового шока, гибридизация второй диагонали была существенно понижена. Наконец, если диагонали получали из клеток с очень активным синтезом мРНК теплового шока, то вторая диагональ при гибридизации вообще была не видна (как и третья), и выявлялась лишь диагональ, соответствовавшая не сшитой с гистонами ДНК- Общий вывод, сделанный из работ с использованием метода ДНК-белковых сшивок, состоял в том, что при транскрипции движущаяся вдоль цепи ДНК РНК-полимераза обратимо сталкивает нуклеосомы с ДНК и транскрибирует фактически голую ДНК. Если уровень транскрипции невысок и РНК-полимераз, ползущих вдоль ДНК, немного, то нуклеосомы успевают образоваться вновь на участке, через который РНК-полимераза уже прошла. Если же транскрипция идет активно, то нуклеосомная структура ДНК не успевает восстановиться, и ДНК вообще лишена гистонов. В то же время постулируется, что организация нуклеосом в активном хроматине практически не отличается от таковой в неактивном. Недавно А. Д. Мирзабеков и сотр. воспроизвели опыты по пришивке гистонов к ДНК с помощью другого метода, путем обработки изолированных ядер препаратами платины. Этот метод мягче диметилсульфатного. Были получены принципиально те же результаты.

Наряду с этой группой данных имеются исследования, в которых авторы приходят к несколько отличным выводам. В. Гаррард и А. Ворсел (США), изучая состояние активных генов в хроматине с помощью нуклеазного гидролиза и с помощью электронной микроскопии, пришли к выводу о том, что нуклеосомы в активном хроматине остаются, но претерпевают структурные изменения типа разворота, превращаясь в полунуклеосомы. В результате на электрофореграммах гидролизатов микрококковой нуклеазой периодичность ~ 200 п. н. заменяется периодичностью ~ 100 п. н. При электронной микроскопии число бусин удваивается, а их размеры уменьшаются. Предполагается, что РНК-полимераза может проходить через такие развернутые нуклеосомы.

В пользу этой возможности говорят и данные, полученные Т. Коллером (Швейцария). Им разработан оригинальный метод изучения нуклеосом. Клетки обрабатывают псораленом, веществом, которое связывается с ДНК, и затем при УФ облучении сшивает между собою две цепи ДНК. Однако если ДНК входит в состав нуклеосом, реакции ее с псораленом не происходит. Поэтому, если выделенную из обработанных клеток ДНК проденатурировать в присутствии формальдегида (он препятствует ренатурации ДНК), то при электронной микроскопии на ДНК видны чередующиеся пузырьки (две цепи денатурировавшей ДНК), соответствующие нуклеосомам, связанные между собою ординарными нитями (сшитая, не способная к денатурации ДНК), соответствующими межнуклеосомным линкерам. Вначале изучали активно транскрибируемые гены рибосомной РНК, входящие в состав экстрахромосомных структур и поэтому легко анализируемые с помощью электронной микроскопии. В них пузырьки, соответствующие нуклеосомам, не видны, т. е. по всей вероятности, гистоны полностью удаляются из транскрибируемых областей. Интересно, что в нетранскрибируемых областях, спейсерах, пузырьки в ДНК (нуклеосомы) хорошо видны.

Однако на мини-хромосомах SV40, которые транскрибируются РНК-полимеразой II, а не РНК-полимеразой I, как гены рибосомной РНК, были получены другие результаты (рис. 28). Транкскрипционно активные мини-хромосомы выявляются благодаря наличию на них растущих цепей РНК (обычно одной или двух). Такие мини-хромосомы составляют 1-2 % от всех мини-хромосом, выделенных из клетки. Они, однако, содержат то же самое число пузырьков, что и неактивные мини-хромосомы, причем их размеры одинаковы в обоих случаях. Наиболее интересным является то, что цепи РНК отходят как от линкеров, так и непосредственно от пузырьков, т. е. РНК-полимераза, очевидно, транскрибирует нуклеосомы. Эти данные свидетельствуют в пользу разворота нуклеосом и транскрипции их РНК-полимеразой.

Все перечисленные выше результаты не являются прямыми, и поэтому окончательное решение вопроса о судьбе нуклеосом при транскрипции должны дать будущие эксперименты.

Модификация гистонов и гистоновые варианты: связь с активным хроматином . Еще в начале 60-х годов Олфри (США) показал, что гистоны могут подвергаться различным модификациям. Так, гистон HI фосфорилируется по ε-аминогруппам лизинов. Гистоны H3 и H4 ацетилируются по тем же группам. Имеется и ряд других модификаций (метилирование, ADP - рибозилирование, убикитинирование и др.).

Сразу возникло предположение, что энзиматические модификации гистонов могут влиять на структуру хроматина и на его активность. Действительно, при фосфорилировании лизина происходит замена одного положительного заряда в гистоне на отрицательный, при апеллировании - утрата положительного заряда и т. д. Именно благодаря таким изменениям в заряде модифицированные гистоны можно отделить от немодифицированных при проведении гель-электрофореза в ацетатном буфере с мочевиной. Так, в высокоразрешающем электрофорезе гистон H4 дает не одну, а четыре полосы, соответствующие молекулам, не ацетилированным и ацетилированным по одному, двум и трем остаткам лизина. В разных тканях соотношение между фракциями меняется. Разделяются на несколько фракций гистоны H3, H2a, H2b и H1 (разная степень ацетилирования и фосфорилирования).

К сожалению, до настоящего времени отсутствуют хорошие методы разделения транскрипционно активного и неактивного хроматина и поэтому трудно приписать измененные формы гистонов тому или иному состоянию хроматина. Наиболее интересные данные в этом направлении были получены тем же В. Олфри (США). При гидролизе активного хроматина он выделил необычные частицы, которые седиментировали в сахарозном градиенте медленнее, чем обычные нуклеосомы, и, по мнению автора, соответствовали развернутым нуклеосомам. В этих частицах, названных А-частицами, присутствовали все сердцевинные гистоны. В отличие от нормальных нуклеосом SH-группы гистона H3 в А-частицах были доступны для ряда химических реагентов, и благодаря этому А-частицы можно отделить от нуклеосом с помощью фракционирования на колонках с хлормеркурибензоатом (реагент, связывающий SH-группы). В А-частицах повышено содержание ацетилированных форм гистонов. Автор предполагает, что ацетилирование гистонов при активации хроматина ведет к развороту нуклеосомных частиц, а это, в свою очередь, повышает доступность SH-групп гистона H3.

Некоторые из гистонов кодируются более чем одним типом генов. В результате для этих гистонов существует несколько вариантов, немного различающихся по своей аминокислотной последовательности. Иногда в процессе онтогенеза происходит закономерная замена одного подкласса гистона на другой. Остается, однако, неясным, имеет ли это какое-либо регуляторное значение. Вопрос, очевидно, может быть также решен после разработки адекватных методов выделения транскрипционно активного хроматина.

Особое положение занимает гистон H1. Для него существуют варианты, резко отличающиеся по своей структурной организации. Таким вариантом является, например, гистон Н5, который замещает значительную часть гистона H1 в ядрах эритроцитов птиц. По всей вероятности, это замещение является важным фактором полного выключения транскрипции в ядрах эритроцитов. В обычных клетках существует вариант гистона H1 - гистон H1 0 . Его содержание составляет малую долю от всего гистона H1. Есть ряд противоречащих друг другу данных о том, что H1 0 связан с активными генами или, наоборот, с устойчиво выключенными генами. Вопрос остается открытым.

Белки HMG могут участвовать в организации активного хроматина 1* . Помимо гистонов, хроматин содержит множество негистоновых белков, функция которых не известна. Среди них, очевидно, должны быть структурные белки, ферменты, обеспечивающие протекание процессов репликации, транскрипции и др., и регуляторные белки. Э. Джонс (Великобритания) попытался выделить белковые компоненты, присутствующие в достаточно большом количестве, что позволило бы провести их анализ и идентификацию. Ему действительно удалось изолировать новый класс ядерных белков, названный им "группой белков с высокой подвижностью" (high mobility group ), или HMG-белки. Название зависело от высокой подвижности этих белков при электрофорезе в геле. Фракция HMG-белков распадается на ряд индивидуальных компонентов. Среди них наиболее представительны и хорошо охарактеризованы HMG-1, HMG-2, HMG-14 и HMG-17.

HMG-белки имеют невысокую молекулярную массу. Они обогащены как основными, так и дикарбоновыми аминокислотами. Содержание HMG-белков составляет примерно 7ю от содержания гистонов. В ядрах из разных типов клеток оно может варьировать. В данном контексте нас больше всего интересуют белки HMG-14 и HMG-17, для которых были получены данные о возможной роли в активации транскрипции. Х. Вайнтрауб (США) показал, что экстракция ядер 0,35 М NaCl, которая извлекает HMG-белки, меняет некоторые свойства активного хроматина, которые восстанавливаются при добавлении к хроматину HMG-14 и HMG-17. Г. Диксон (Канада) обнаружил эти белки в составе нуклеосом, освобождавшихся из хроматина на ранних этапах гидролиза нуклеазой, которые, по его данным, были обогащены ДНК тракстипционно активных генов.

Концам [ 32 Р] и затем гибридизовали с гяРНК из L-клеток. Гибриды выявляли путем гельфильтрации. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальная ДНК клетки (по результатам, полученным В. В. Бакаевым и соавт.)">
Рис. 29. Возможная связь HMG-белков (14 и 17) с активным хроматином. а - выявление субнуклеосом в гидролизатах хроматина микрококковой нуклеазой. На разных этапах гидролиза появляются те или иные фракции субнуклеосом. Электрофорез велся в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Окраска этидийбромидом, на правом столбике - флюорография; б - использование двумерного электрофореза для выяснения белкового состава субнуклеосом CH2 и CH3. Хроматин, меченный [ 14 С] по белку, гидролизовали микрококковой нуклеазой и разделяли двумерным электрофорезом (1-е направление - недиссоциирующая среда, 2-е направление - раствор додецилсульфата натрия), после чего вели авторадиографию для выявления белков. Буквами указаны HMG-белки, которые в момент проведения опыта еще не были идентифицированы с известными. Сейчас мы знаем, что А - это HMG-1, В - HMG-2, E - HMG-14, G - HMG-17, HMG-белки F и H идентифицированы неточно, вероятно, H тоже соответствует HMG-17. Видно, что HMG-белки входят в состав мононуклеосом (МН-2 и МН-3) и субнуклеосом CH-2 (HMG-17) и CH-3 (HMG-14); в - демонстрация обогащения ДНК CH-2 и CH-3 транскрибирующимися последовательностями. ДНК, выделенную из полос CH-2 и CH-3 L-клеток, метили по 5"-концам [ 32 Р] и затем гибридизовали с гяРНК из L-клеток. Гибриды выявляли путем гельфильтрации. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальная ДНК клетки (по результатам, полученным В. В. Бакаевым и соавт.)

В. В. Бакаев в нашей лаборатории пришел к выводу о роли HMG-белков в транскрипции с помощью другого экспериментального подхода. При электрофоретическом анализе гидролизатов хроматина он выявил, помимо нуклеосом и олигонуклеосом, минорные компоненты, обладающие большей подвижностью. Они были названы субнуклеосомами и, очевидно, являлись продуктами дальнейшего распада нуклеосомы (рис. 29, табл. 5). Субнуклеосома СН-7 соответствовала нуклеосоме, утратившей по одной молекуле Н2а и Н2Ь и содержавшей ДНК, укороченную на 40 п. н., СН-6 соответствовала комплексу ДНК длиной 30-40 п. н. с гистоном H1, отщепляющемуся от МН-2 при ее превращении в МН-1. СН-4 содержала отрезок ДНК и пару гистонов H2a и H2b (продукт реакции МН-1→СН-7→СН-4). Две субнуклеосомы, СН-3 и СН-2, состояли из короткой ДНК и HMG-белков (HMG-14 и HMG-17). Можно было предположить, что они являются участками линкера, связанными с белками HMG-14 и HMG-17, переходящими в раствор при переваривании соответствующих нук-леосом. СН-2 и СН-3 были собраны, из них выделена ДНК, которую метили по концам и изучали ее гибридизацию с ядерной РНК. Оказалось, что ДНК из СН-2 и СН-3 гораздо эффективнее гибридизуется с ядерной РНК, чем тотальная, фрагментированная до тех же размеров ДНК клетки.

Отсюда был сделан вывод, что ДНК, связанная с белками HMG-14 и HMG-17, вероятно, происходит из транскрипционно активного хроматина.

Все эти данные, полученные независимо, позволили предположить, что HMG-14 и HMG-17 каким-то образом связаны с активацией генов. Механизм активации был, однако, совершенно непонятным. HMG-14 и HMG-17 не могли быть первичными факторами, включающими ген, так как они лишены специфичности. Можно было думать, что они участвуют в поддержании "открытой конформации" активного хроматина.

В последующие годы появился скептицизм относительно роли HMG-14 и HMG-17 в активации хроматина. В частности, недавно А. Д. Мирзабеков и сотр. с помощью метода гибридизации с белковыми тканями получили данные об обеднении активного хроматина HMG-14 и HMG-17. Поскольку, однако, все вышеперечисленные данные являются косвенными, в целом вопрос о роли HMG-белков остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Топоизомераза I и белки, прочно связанные с ДНК, входят в состав транскрипционно активного хроматина 1* . С. Элгин (США), а за нею ряд других авторов показали, что транскрипционно активный хроматин содержит топоизомеразу I, фермент, релаксирующий суперспирализованную ДНК. Впервые это было продемонстрировано на цитологических препаратах политенных хромосом дрозофилы с помощью флюоресцирующих антител к топоизомеразе I. Этот фермент вносит в ДНК одноцепочечный разрыв и ковалентно связывается с образовавшимся 5"-концом ДНК. Это позволяет ДНК свободно вращаться в месте разрыва. Затем фрагмент отщепляется, а фосфодиэфирная связь в ДНК восстанавливается. По молекулярной массе топоизомераза I, или сокращенно топо I, гетерогенна. Наиболее тяжелый компонент имеет молекулярную массу 135 кДа , а наиболее богато представленный - 80 кДа. При ее расщеплении протеиназами образуются более короткие полипептиды, сохраняющие тем не менее ферментативную активность.

Антибиотик каптотецин является ингибитором топо I, причем при обработке им клеток фермент образует ковалентные сшивки с ДНК в том месте, где он находился в момент контакта с антибиотиком. Место таких сшивок легко определить методом картирования с помощью гибридизационной метки. Этим путем было обнаружено, что топо I присутствует исключительно в транскрибируемых областях генома, т. е., вероятнее всего, она работает в кооперации с РНК-полимеразой II, снимая возникающие при транскрипции местные перекручивания ДНК.

Другим белковым компонентом, выявляемым в транскрибируемых областях генома, является набор белков, прочно связанных с ДНК (ПСБ), которая соответствует транскрибируемой ДНК клетки (см. разд. 3.4).

С. В. Разиным и В. В. Чернохвостовым была сделана попытка детально охарактеризовать комплексы ДНК с ПСБ. Фрагменты ДНК длиной в 1-2 т. п. н., связанные с ПСБ, очищали и подвергали равновесному ультрацентрифугированию в градиенте плотности CsCl. Их плавучая плотность оказалась равной 1,7 г / см 3 , т. е. она соответствовала плавучей плотности свободной ДНК, не содержащей белка. В ходе опытов, поставленных для объяснения этого парадокса, было обнаружено, что обработка ДРНКазой ведет к уменьшению плавучей плотности комплексов до 1,62-1,65 г / см 3 . Приблизительные расчеты, основанные на плотности белка (~ 1,3 г / см 3 ) и РНК (~ 1,9 г / см 3 ), (показывают, что на каждую молекулу ДНК приходится около 150 кДа белка и около 200 нуклеотидов РНК. Природа этой РНК неясна, но получены данные о ее гомогенности и уникальной нуклеотидной последовательности.

Таким образом, многое в отношении комплексов ДНК с ПСБ остается загадочным, но, по всей вероятности, им принадлежит существенная роль в организации транскрипционной машины. Их исследование продолжается в настоящее время.

Деметилирование ДНК в транскрибирующихся генах 2* . Еще одной важной особенностью активного хроматина является деметилирование определенных участков ДНК. В неактивных генах большая часть цитидиловых остатков в составе CG-последовательностей метилируется. Впервые Б. В. Ванюшиным в лаборатории А. Н. Белозерского было продемонстрировано, что ДНК в разных тканях одного животного различаются по уровню метилирования С. На основании этого было высказано предположение о возможной регуляторной роли метилирования в дифференцировке. Позднее многими авторами было показано, что в транскрибирующейся ДНК некоторые области оказываются недометилированными. Наиболее широко используемый метод анализа - сравнение рестриктных карт, полученных с рестриктазами, узнающими одну и ту же последовательность, например CGCG или CCGG, но обладающими разной чувствительностью к метилированию. Одна из рестриктаз расщепляет и метилированную и неметилированную последовательности, а другая - только неметилированную. Обычно неметилированные последовательности локализованы в регуляторной области гена. Область собственно гена, его кодирующей части и интронов одинаково метилирована как в работающих, так и в молчащих генах.

При введении в клетки метилированной ДНК ее экспрессия в клетке оказывается значительно сниженной по сравнению с неметилированной ДНК. Получены данные, согласно которым при репликации ДНК состояние метилирования ДНК воспроизводится: если одна из цепей метилирована, то новообразованная цепь также метилируется в том же самом месте.

Одно время складывалось впечатление, что метилирование-деметилирование цитидина в CG-последовательностях регуляторной области - это главный механизм инактивации-активации гена. Однако в последнее время появился ряд данных, противоречащих этой гипотезе. Так, полностью метилированная по CG ДНК SV40 активно экспрессируется. В то же время в ДНК дрозофиллы вообще не выявляется метилцитозин. Возможно, что деметилирование С является следствием активации гена и лишь закрепляет состояние транскрипционной активности. Здесь, как и в других областях изучения активации гена, нужны новые эксперименты.

Генетический материал эукариотических организмов имеет очень сложную организацию. Молекулы ДНК, находящиеся в клеточном ядре, входят в состав особого многокомпонентного вещества – хроматина.

Определение понятия

Хроматином называется содержащий наследственную информацию материал клеточного ядра, представляющий собой сложный функциональный комплекс ДНК со структурными белками и другими элементами, обеспечивающими упаковку, хранение и реализацию кариотического генома. В упрощенной трактовке это вещество, из которого состоят хромосомы. Термин происходит от греческого "хрома" – цвет, краска.

Понятие было введено Флемингом еще в 1880 году, но до сих пор идут споры о том, что такое хроматин, с точки зрения биохимического состава. Неопределенность касается небольшой части компонентов, не участвующих в структурировании генетических молекул (некоторые ферменты и рибонуклеиновые кислоты).

На электронной фотографии интерфазного ядра хроматин визуализируется как многочисленные участки темной материи, которые могут быть мелкими и разрозненными или объединяться в крупные плотные скопления.

Конденсация хроматина во время клеточного деления приводит к образованию хромосом, которые видны даже в обычном световом микроскопе.

Структурные и функциональные компоненты хроматина

С целью определить, что такое хроматин на биохимическом уровне, ученые экстрагировали это вещество из клеток, переводили в раствор и в таком виде изучали компонентный состав и структуру. При этом использовались как химические, так и физические методы, включая технологии электронной микроскопии. Выяснилось, что химический состав хроматина на 40% представлен длинными молекулами ДНК и почти на 60% – различными белками. Последние подразделяются на две группы: гистоны и негистоновые.

Гистонами называют большое семейство основных ядерных белков, которые прочно связываются с ДНК, формируя структурный скелет хроматина. Их количество примерно равно процентному содержанию генетических молекул.

Остальная часть (до 20%) протеиновой фракции приходится на ДНК-связывающие и пространственно-модифицирующие белки, а также ферменты, принимающие участие в процессах считывания и копирования генетической информации.

Помимо основных элементов, в составе хроматина в небольшом количестве обнаруживаются рибонуклеиновые кислоты (РНК), гликопротеиды, углеводы и липиды, однако вопрос об их ассоциации с ДНК-упаковочным комплексом до сих пор открыт.

Гистоны и нуклеосомы

Молекулярная масса гистонов варьирует в пределах от 11 до 21 кДа. Большое количество остатков основных аминокислот лизина и аргинина придают этим белкам положительный заряд, способствуя формированию ионных связей с противоположно заряженными фосфатными группами двойной спирали ДНК.

Выделяют 5 разновидностей гистонов: H2A, H2B, H3, H4 и H1. Первые четыре типа участвуют в формировании основной структурной единицы хроматина – нуклеосомы, которая состоит из кора (белковой сердцевины) и обмотанной вокруг него ДНК.

Нуклеосомный кор представлен октамерным комплексом из восьми молекул гистонов, в который входят тетрамер H3-H4 и димер Н2A-H2B. Участок ДНК протяженностью около 146 нуклеотидных пар накручивается на поверхность белковой частицы, образуя 1,75 витка, и переходит в линкерную последовательность (примерно 60 н. п.), соединяющую нуклеосомы друг с другом. Молекула H1 связывается с линкерной ДНК, защищая ее от действия нуклеаз.

Гистоны могут подвергаться различным модификациям, таким как ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, ADP-рибозилирование и взаимодействие с убивиктиновым белком. Эти процессы влияют на пространственную конфигурацию и плотность упаковки ДНК.

Негистоновые белки

Существует несколько сотен разновидностей негистоновых белков с различными свойствами и функциями. Их молекулярная масса варьирует от 5 до 200 кДа. Особую группу составляют сайт-специфические белки, каждый из которых комплементарен определенному участку ДНК. В эту группу входят 2 семейства:

"цинковые пальцы" – узнают фрагменты длиной в 5 нуклеотидных пар;
гомодимеры – характеризуются структурой "спираль-поворот-спираль" во фрагменте, связанном с ДНК.

Лучше всего изучены так называемые белки высокой подвижности (HGM-белки), постоянно ассоциированые с хроматином. Такое наименование семейство получило из-за высокой скорости перемещения белковых молекул в электрофорезном геле. Эта группа занимает большую часть негистоновой фракции и включает в себя четыре основных типа HGM-белков: HGM-1, HGM-14, HGM-17 и HMO-2. Они выполняют структурную и регуляторную функции.

К негистоновым белкам относят также ферменты, обеспечивающие транскрипцию (процесс синтеза матричной РНК), репликацию (удвоение ДНК) и репарацию (устранение повреждений в генетической молекуле).

Уровни компактизации ДНК

Особенность структуры хроматина такая, что позволяет нитям ДНК с суммарной длиной более метра поместиться в ядро диаметром около 10 мкм. Такое возможно благодаря многоступенчатой системе упаковки генетических молекул. Общая схема компактизации включает пять уровней:

нуклеосомная нить диаметром 10–11 нм;
фибрилла 25–30 нм;
петлевые домены (300 нм);
волокно толщиной 700 нм;
хромосомы (1200 нм).

Такая форма организации обеспечивает уменьшение длины исходной молекулы ДНК в 10 тысяч раз.

Нить диаметром 11 нм образована рядом нуклеосом, связанных линкерными участками ДНК. На электронной микрофотографии такая структура напоминает нанизанные на леску бусы. Нуклеосомная нить сворачивается в спираль по типу соленоида, образуя фибриллу толщиной 30 нм. В ее формировании участвует гистон H1.

Соленоидная фибрилла складывается в петли (иначе – домены), которые закрепляются на поддерживающем внутриядерном матриксе. Каждый домен содержит от 30 до 100 тысяч пар нуклеотидов. Такой уровень компактизации характерен для интерфазного хроматина.

Структура толщиной 700 нм образуется при спирализации доменной фибриллы и называется хроматидой. В свою очередь, две хроматиды формируют пятый уровень организации ДНК – хромосому диаметром 1400 нм, которая становится видна на стадии митоза или мейоза.

Таким образом, хроматин и хромосома – это формы упаковки генетического материала, зависящие от жизненного цикла клетки.

Хромосомы

Хромосома состоит из двух идентичных друг другу сестринских хроматид, каждая из которых образована одной суперспирализованной молекулой ДНК. Половинки соединяются особым фибриллярным тельцем, называемым центромерой. Одновременно эта структура является перетяжкой, разделяющей каждую хроматиду на плечи.

В отличие хроматина, представляющего собой структурный материал, хромосома – это дискретная функциональная единица, характеризующаяся не только структурой и составом, но и уникальным генетическим набором, а также определенной ролью в реализации механизмов наследственности и изменчивости на клеточном уровне.

Эухроматин и гетерохроматин

Хроматин в ядре существует в двух формах: менее спирализованной (эухроматин) и более компактной (гетерохроматин). Первая форма соответствует транскрипционно-активным участкам ДНК и поэтому структурирована не так плотно. Гетерохроматин подразделяется на факультативный (может переходить из активной формы в плотную неактивную в зависимости от стадии жизненного цикла клетки и необходимости реализовать те или иные гены) и конститутивный (постоянно уплотнен). Во время митотического или мейотического деления весь хроматин неактивен.

Конститутивный гетерохроматин обнаружен возле центромер и в концевых участках хромосомы. Результаты электронной микроскопии показывают, что такой хроматин сохраняет высокую степень конденсации не только на стадии деления клетки, но и во время интерфазы.

Биологическая роль хроматина

Основная функция хроматина заключается в плотной упаковке большого количества генетического материала. Однако просто уместить ДНК в ядре для жизнедеятельности клетки недостаточно. Необходимо, чтобы эти молекулы должным образом "работали", то есть, могли передавать заключенную в них информацию по системе ДНК-РНК-белок. Кроме этого, клетке нужно распределять генетический материал во время деления.

Устройство хроматина полностью отвечает этим задачам. Белковая часть содержит все необходимые ферменты, а особенности структуры позволяют им взаимодействовать с определенными участками ДНК. Поэтому, второй важной функцией хроматина является обеспечение всех процессов, связанных с реализацией ядерного генома.

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу. ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9*10 6 . Такую сравнительно малую массу ДНК из препаратов можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют различные организмы, как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека, в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что “избыточное” количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 10 2 до 10 5 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями (гены для белков хроматина - гистонов).

часто повторяющиеся последовательности (>10 6 раз), входящие во фракцию сателитной ДНК и не транскрибирующиеся;

фракция умеренно повторяющихся последовательностей (10 2 -10 5), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному;

фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Представим себе, что у эукариотических клеток каждая из хромосомных ДНК, как и у бактерий, является одним репликоном. В этом случае при скорости синтеза 0,5 мкм в минуту (для человека) редупликация первой хромосомы с длиной ДНК около 7 см должна занять 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом же деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает 7-12 ч.